近日，北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室王晶团队在学术期刊《Angewandte Chemie International Edition》发表了题为“Monitoring the Dynamic Regulation of the Mitochondrial GTP-to-GDP Ratio with a Genetically Encoded Fluorescent Biosensor”（开发遗传编码的生物荧光探针监测线粒体中GTP与GDP比值的动态变化）的研究工作。

GTP和GDP的代谢和转化在广泛的生物学过程中发挥关键作用，能够为生物合成提供能量，或参与广泛的信号转导。GTP和GDP的代谢和转化广泛存在于这些相关的生理过程或病理过程中，通常由复杂的酶系统调节，因而GTP/GDP比值可以作为细胞信号转导和能量代谢状态变化的敏感且重要的指标。然而，针对GTP和GDP比值指标的活细胞动态监测始终是一项极具挑战性的难题。更为重要的是，相比较检测GTP或GDP绝对浓度获得的能量代谢的信息，精准检测细胞内GTP与GDP的相对浓度可以更好地解释鸟苷酸能量代谢变化的生物学意义。因此，发展一种光学工具来实时报告活细胞的GTP/GDP比率具有非常重要的科学意义和应用价值。

基于此，北京大学药学院王晶团队，利用遗传编码的荧光蛋白传感器技术实现了对GTP/GDP比率的时空特异性和实时动态监测。探针设计选择Ct-eIF5B的结构域Ⅰ作为“GTP/GDP感知元件”，继而将“报告元件”循环重排黄色荧光蛋白（cpYFP）插入到Ct-EIF5B的结构域Ⅰ中，cpYFP会对其N端或C端的蛋白结构变化敏感，当GTP或GDP与该融合蛋白（GRIser）结合后，会诱导蛋白构象变化，从而产生相应的荧光信号。

此外本研究利用计算机辅助设计和蛋白分子定向进化技术，对该GTP/GDP比值的荧光探针进行了深度优化。通过对突变位点设计高效完整的筛选工作流程，并综合评价各个突变体的响应幅度、亲和力等体外特征，开发了性能优良的遗传编码的GTP/GDP比值的荧光探针（GRIserHR）。GRIserHR具有极好的荧光稳定性、选择性和敏感性（亚微摩尔）。随后，该团队通过引入适当的信号肽与传感器融合，构建得到GRIserHR的突变体，从而实现了对活细胞内亚细胞区室中的GTP/GDP比值的监测，为实时动态研究活细胞中亚细胞尺度的GTP/GDP比值奠定了坚实基础。

同时，该团队还将GRIserHR用于探究PEPCK-M和SCS酶功能扰动后是如何差异性地调控胞质和线粒体GTP/GDP比值的水平。实验结果表明线粒体中GTP/GDP比值独立于细胞质GTP/GDP比值的变化。总之，利用GRIserHR探针可以加强对线粒体代谢机制的深入理解，以及通过发现影响 GTP-GDP相互转换的特异性靶标，展开激活剂和抑制剂的高通量筛选工作。本工作也为GTP/GDP比值作为代谢动态指标提供了确凿的证据，进一步完善了中心碳代谢分子研究的监测工具库。

北京大学药学院研究员王晶研究员为本研究论文的通讯作者。北京大学药学院博士研究生张美琪和北京大学药学院六年制研究生杨波为论文的共同第一作者。该工作得到科技部重点研发计划和国家自然科学基金委等项目资助。

左起：张美琪（博士研究生），王晶（研究员），杨波（六年制硕士研究生）

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202201266

王晶，博士，北京大学药学院研究员、博士生导师、天然药物及仿生药物国家重点实验室PI。入选国家海外高层次人才计划。长期致力于利用化学生物学方法研究小分子对生物大分子的调控机制和开发相应的基于遗传编码的生物荧光探针。至今以第一作者或通讯作者身份在Nat. Chem.、Nat. Biotechnol.、Angew. Chem. Int. Ed. 等国际重要学术期刊上发表多篇学术论文。

天然药物及仿生药物国家重点实验室 供稿