2024年11月28日，我院天然药物及仿生药物全国重点实验室刘涛教授团队联合中国地质大学（武汉）娄筱叮教授团队在国际著名学术期刊Nature Chemistry上发表了题为“Designing Artificial Fluorescent Proteins and Biosensors by Genetically Encoding Molecular Rotor-based Amino Acids”的研究工作。
荧光技术是分子生物学研究中的核心工具， 尤其是荧光蛋白 （如绿色荧光蛋白 GFP），凭借其可遗传编码性、丰富的色彩变化和出色的稳定性，为研究生物分子的定位、相互作用及动态行为提供了强有力的支持。然而，传统的荧光蛋白仍面临一些显著挑战：它们的分子体积较大（通常超过20 kDa），需要与目标蛋白进行末端融合，且可能干扰蛋白的天然功能和定位。此外，传统的荧光传感器多依赖于融合标记蛋白或荧光染料， 这些方法在活细胞环境中的适应性和信噪比往往不佳，限制了其广泛应用。
针对这些瓶颈，该研究团队受到荧光蛋白发色团的化学特性的启发，设计了一类荧光分子转子型氨基酸 （Fluorescent Molecular Rotor Amino-acid, FMR-AA）。通过结合遗传密码子扩展技术，团队成功将 FMR-AA 以点突变的形式引入目标蛋白。这一全新策略融合了荧光蛋白的可遗传编码优势与化学染料分子的微型化和拓展性，不仅能简便高效地构建各种人造荧光蛋白，还能开发出高灵敏度的生物传感器，是生物成像和分子检测技术的新突破。
FMR-AA拥有一种特别的“隐身”能力。在溶液中，它保持非荧光状态，一旦进入高粘度环境或折叠成熟后的蛋白质中，它便能被激发出明亮的荧光。因此，该研究团队突破了传统荧光蛋白的β-桶结构限制，将FMR-AA引入到任意天然蛋白质中，并通过蛋白进化和筛选，成功获得了具有和GFP相同荧光原理的全新荧光蛋白。这些人造荧光蛋白在结构和尺寸上展现出多样性，其中最小的结构仅为 7 kDa。随后，他们还在细菌和哺乳动物细胞中验证了这些人造荧光蛋白免洗的动态成像能力，为生物成像技术打开了新的大门。
经典的遗传编码荧光蛋白生物传感器通常依赖于复杂的构建方法，如循环重排荧光蛋白（Cp-FP） 或利用两个融合荧光蛋白之间的 FRET 效应。这些方法往往需要繁琐的接头序列筛选和优化，耗时且挑战重重。而 FMR-AA 的微环境敏感性为生物传感器的开发提供了一条简便且高效的新路径。该团队利用FMR-AA成功开发了多种蛋白质荧光生物传感器，能够实时监测蛋白质构象变化、蛋白质-蛋白质相互作用以及细胞内代谢物的动态变化。例如，他们将FMR-AA引入到钙调蛋白（CaM）的关键位点，经过简单的改进和优化，成功构建了一种高信噪比、快速响应的钙离子传感器。这款传感器能够在哺乳动物活细胞中实时监测钙离子浓度的动态变化。利用这一通用策略，该团队还设计了可以灵敏检测葡萄糖、GTP和谷氨酰胺浓度的荧光传感器，拓展了FMR-AA在生物检测中的应用。此外，该团队还展示了FMR-AA作为动态探针检测蛋白质相互作用的独特能力。还展示了FMR-AA用作检测蛋白质相互作用的动态探针的能力。他们将FMR-AA引入到 FRB 和 FKBR 这两种经典的相互作用蛋白的结合界面，通过荧光信号的变化实现了对这两种蛋白质相互作用过程的实时监测。该方法在体外抗原抗体相互作用和活细胞水平蛋白质互作上均表现出极高的灵敏度， 为分子生物学中的蛋白质互作研究提供了更为精确和高效的检测手段。
综上所述，该研究在技术上突破了传统荧光蛋白和生物探针开发方法的局限，展现了小型化、灵活性和简便性的优势，同时具有广泛的适用性和优异的信噪比，尤其在活细胞动态观测中表现出色。这项技术不仅推动活细胞成像、生物分子互作研究及代谢物检测等领域的发展，还为分子可视化工具的定制化开发开辟了新的方向。随着技术的不断完善，FMR-AA有望为揭示复杂生命过程提供更加高效、易用的研究工具，为生命科学研究带来新的突破。
北京大学药学院刘涛教授和中国地质大学（武汉）娄筱叮教授为研究论文的共同通讯作者。北京大学药学院博士研究生胡利明（2024年毕业）、中国科学院深圳先进技术研究院博士后曹文兵为论文的共同第一作者。该工作得到科技部重点研发计划和国家自然科学基金委等项目资助。
论文链接：https://www.nature.com/articles/s41557-024-01675-x
【作者简介】
刘涛，北京大学博雅特聘教授，国家杰出青年科学基金、国家优秀青年科学基金、北京市杰出青年科学基金获得者。北京大学药学院分子与细胞药理学系主任。Journal of Molecular Biology 和Chinese Chemical Letter 杂志编委。中国医药生物技术协会合成生物学分会委员、中国生物工程学会合成生物学分会青年工作组委员。获中国药学会生物医药青年奖、拜耳学者奖、屠呦呦青年学者奖、北大王选青年学者奖等。以通讯作者身份在Nat Chem、Nat Chem Biol、Mol Cell、Nat Commun、Sci Adv、Chem、JACS、ACIE等发表论文30余篇。研究集中在基于细胞工程的蛋白质非天然氨基酸编码技术，通过化学修饰实现蛋白质，病毒以及细胞等生物技术药物的升级换代与创新。
娄筱叮，中国地质大学（武汉），教授，博士生导师，国家优青，国家青拔，国家重点研发计划青年项目首席科学家。主要研究方向为蛋白质活细胞分析及调控，场效应晶体管生物传感器件的构筑及应用等。包括Nat. Chem.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Anal. Chem.、Natl. Sci. Rev.、Acc. Chem. Res.、Adv. Mater.、ACS Nano、Nano Lett.等。全部论文引用10000余次，H指数60。获评中国分析测试协会科学技术奖CAIA奖一等奖（第一完成人）、湖北省青年五四奖章、湖北省自然科学一等奖（第三完成人）。担任中青科协理事、全国青联委员、湖北省政协委员。担任中国生物材料学会影像材料与技术分会委员、中国人体健康科技促进会临床检验科学技术转化专业委员会委员、中国感光学会光学传感与诊疗专委会委员。
胡利明，北京大学药学院化学生物学专业2020级博士研究生，研究方向为蛋白质进化与化学修饰和遗传编码生物荧光探针的开发。目前以第一作者或共同作者身份在Nature Chemistry、ACS synthetic biology、J Am Chem Soc等杂志上发表多篇学术论文。
曹文兵，博士（2022年毕业），现为中国科学院深圳先进技术研究院博士后，研究方向为蛋白质进化与合成生物学。目前以第一作者（含共同）在Nature Chemistry、Chem、Angew. Chem. Int. Ed.等杂志上发表多篇学术论文。
天然药物及仿生药物全国重点实验室 供稿
