5月30日，学术期刊《Nature Chemistry》在线发表北京大学化学与分子工程学院陈兴课题组与我院天然药物及仿生药物国家重点实验室、化学生物学系董甦伟课题组合作完成、题为 “O-GlcNAcylation modulates liquid-liquid phase separation of SynGAP/PSD-95”的研究成果。
细胞中除了膜包被的细胞器外，还存在一类无膜包被或者半膜包被、可以富集生物大分子的结构，例如核仁、应激颗粒（Stress granule），以及神经元中的突触后致密区（postsynaptic density, PSD)等。近年来的研究发现这类结构一般是通过蛋白-蛋白或蛋白-RNA相互作用形成液–液相分离（Liquid-liquid phase separation, LLPS）而产生。大量研究表明，翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）可以通过改变氨基酸残基间的相互作用强度实现对LLPS的动态调控，从而在基因表达调控、细胞对外在环境的压力响应、先天免疫应答、神经退行性疾病的发生等方面发挥其重要作用。
尽管多种翻译后修饰已被阐明可以参与LLPS的调控，糖基化修饰对其调控作用却始终未被系统研究和阐释。在解析不同器官与组织中糖基化修饰分布和生物学功能的研究中，陈兴课题组发现PSD的重要组成蛋白SynGAP具有多个O-GlcNAc修饰位点，结合此前南方科技大学张明杰课题组观察到SynGAP与PSD中脚手架蛋白PSD-95所形成复合物可发生液-液相分离的现象，研究团队推测O-GlcNAc糖基化修饰可能与该LLPS过程相关。基于此，陈兴课题组、董甦伟课题组、张明杰课题组等协作攻关，阐明了O-GlcNAc修饰对SynGAP/PSD95液–液相分离过程的调控和分子机制。其中，董甦伟课题组利用化学半合成策略获取了特定位点具有O-GlcNAc修饰的均质SynGAP蛋白，在天然蛋白所含多个糖基化位点中，确证了调控其液-液相分离现象的关键修饰位点。
在所鉴定到的众多O-GlcNAc修饰位点中，研究团队选定了位于SynGAP蛋白CC-PBM结构域1159位丝氨酸（S1159）与1306位苏氨酸（T1306）两个位点进行深入研究（图1a）：利用表达蛋白连接（expressed protein ligation, EPL）策略，合成得到S1159与T1306位点特异O-GlcNAc修饰的SynGAP CC-PBM蛋白（图1b）；通过液滴成像实验与沉淀离心实验，证明SynGAP-T1306OG可以完全抑制LLPS发生（图1c）。结合同源结构模拟与体积排阻-静态光散射分析，他们提出SynGAP蛋白T1306位点的O-GlcNAc修饰通过阻碍T1306与PSD-95蛋白369位组氨酸间形成氢键，破坏蛋白相互作用进而阻碍LLPS形成，并在细胞内验证了该机理（图1d-e）。
图1 SynGAP蛋白O-GlcNAc位点鉴定，蛋白合成与抑制LLPS机理
O-GlcNAc修饰通常是亚化学计量，即修饰率不足100%。那么亚化学计量的O-GlcNAc修饰是否能够有效调控LLPS呢？为了回答这一问题，研究团队进一步利用化学合成所得位点特异、均一修饰的PSD-95蛋白，通过混合不含糖基修饰蛋白得到O-GlcNAc修饰比例不同的一系列样品，从而模拟出不同修饰率探究其对LLPS的影响：结果显示不同修饰率（10% ~ 100%）均可产生不同程度的抑制作用；同时发现， O-GlcNAc对于LLPS的抑制呈现出显性负调控（dominant-negative effect）的特征（图2a-b）。此外，O-GlcNAc修饰可以通过加入O-GlcNAc转移酶OGT或去修饰酶OGA动态调节O-GlcNAc水平，从而实现对与LLPS抑制的动态可逆调控（图2c）。
图2 O-GlcNAc修饰对LLPS的显性负调控与OGA动态调控
该工作为诠释O-GlcNAc修饰在调控神经系统发育与突触可塑性等过程中的重要功能提供一个新的机制，同时也为探索O-GlcNAc修饰在其他液-液相分离过程的调控作用提供了新的思路。
该项研究获得科技部重点研发计划、国家自然科学基金等项目资助。北京大学化学学院已毕业博士生吕品欧、杜逸飞和药学院已毕业博士生贺长栋为该论文的共同第一作者，陈兴教授和董甦伟研究员为共同通讯作者。
研究团队部分成员合影 (从左至右：贺长栋，董甦伟)
原文连接：https://www.nature.com/articles/s41557-022-00946-9
【董甦伟研究员简介】
董甦伟，博士，北京大学研究员、博士生导师，药学院化学生物学系主任、天然药物及仿生药物国家重点实验室课题组长。入选国家海外高层次青年人才、北京市优秀青年人才。长期致力于蛋白质化学合成和糖基化功能研究、多肽及蛋白药物的合成及改造，以第一作者或通讯作者身份在Science、J. Am. Chem. Soc.、Adv. Sci.、Angew. Chem. Int. Ed.、Chem. Sci.等学术刊物发表多篇学术论文；作为负责人获国家自然科学基金优秀青年基金项目、北京市自然科学基金杰出青年基金项目等资助。先后获得 “中国药学会-施维雅”青年药物化学奖、中国化学会糖化学青年学者奖等奖励。
天然药物及仿生药物国家重点实验室 供稿
